Cribado de donantes para las infecciones de transmisión mediante transfusiones (ITT)
El cribado de la sangre donada para detectar infecciones de transmisión mediante transfusiones es fundamental para garantizar la seguridad de la sangre y sus componentes. Cuando se utilizan en combinación con inmunoanálisis, las pruebas de ácidos nucleicos (NAT) permiten detectar infecciones y ayudan a reducir el riesgo de que entren virus en el suministro sanguíneo.
NAT para el cribado de donantes de sangre
La importancia del hemocribado se puso de relieve en los años 1980s, cuando miles de pacientes con hemofilia se infectaron por el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) por haber recibido hemoderivados contaminados. En su momento, los análisis de los hemoderivados mediante NAT (una técnica molecular de alta sensibilidad) revelaron tasas altas de contaminación por VHC y promovieron la idea de utilizar NAT además del cribado de antígenos y anticuerpos.
En cada momento posterior a la infección aparecen distintos marcadores de esta. La primera diana detectable que se manifiesta es el ácido nucleico, que forma parte del microbio patógeno natural, seguido unos días después por los antígenos y, posteriormente, los anticuerpos que se crean durante una respuesta inmunitaria. NAT, que detecta la presencia de un virus incluso en cantidades muy pequeñas, puede detectar infecciones antes que los inmunoanálisis (que se utilizan para detectar antígenos y anticuerpos). Por lo tanto, el uso de NAT en combinación con los inmunoanálisis puede reducir aún más el riesgo de que entren virus en el suministro sanguíneo.
¿En qué consiste NAT?
La mayoría de los análisis NAT implican un paso de extracción del ácido nucleico, seguido de su amplificación y detección/cuantificación. NAT incluye diversos métodos, como la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), la reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción previa (RT-RCP), la amplificación mediada por transcripción (AMT), la reacción en cadena de la ligasa (RCL), la amplificación por desplazamiento de cadenas (ADC) y la amplificación por secuencias de ácidos nucleicos (ASAN).
El ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) son los dos tipos principales de ácidos nucleicos. Son polímeros compuestos por nucleótidos formados por un glúcido de tipo pentosa (5 átomos de carbono), un grupo fosfato y una base que contiene nitrógeno. Existen cinco bases diferentes que se unen entre sí para formar pares complementarios específicos: la citosina se une a la guanina y la adenina se une a la timina en el ADN y al uracilo en el ARN. Los oligonucleótidos son polímeros artificiales integrados por secuencias monocatenarias compuestas al menos por dos nucleótidos (normalmente con una longitud de alrededor de 20-40 nucleótidos). Están diseñados específicamente para unirse de forma complementaria a una región conservada de la secuencia diana. Estas regiones se eligen porque no mutan con facilidad.
¿En qué consiste la AMT?
La AMT (amplificación mediada por transcripción) es un análisis NAT isotérmico (realizado a una temperatura constante) en un solo tubo que permite la detección simultánea de varios virus. Este análisis NAT consta de tres pasos (captura de la diana, amplificación y detección). La AMT utiliza tres tipos diferentes de oligonucleótidos: oligonucleótidos de captura en el paso de captura de la diana, cebadores en el paso de amplificación y sondas en el de detección.
Captura de la diana en la AMT
La captura de la diana, el primer paso del análisis, implica la captura de ácidos nucleicos víricos mediante oligonucleótidos específicos para el virus unidos a microesferas magnéticas. Las muestras se preparan para su análisis lisando los virus para que liberen su material genético; no se requiere ningún tratamiento previo ni manipulación. También se introduce un control interno (CI) en cada tubo de reacción durante el paso de captura de la diana, que permite controlar la adición del reactivo correcto y la realización de cada paso a lo largo del procedimiento de análisis. El CI se sitúa en un nivel objetivo bajo para detectar variaciones en la eficiencia de la amplificación debido a problemas con la muestra, el reactivo o el procedimiento.
La captura de la diana se logra mediante el uso de oligonucleótidos de captura que tienen dos secciones, una cola de poli-dA (cadena de residuos de desoxiadenosina [adenina más el glúcido pentosa desoxirribosa]) y una sección homóloga a regiones bien conservadas del material genómico del virus que se hibrida con la diana. La diana hibridada y el CI se capturan en micropartículas magnéticas que tienen moléculas de poli-dT (polidesoxitimidina) unidas mediante enlaces covalentes. El material no unido se lava para eliminar los elementos inespecíficos y minimizar los posibles inhibidores.
Amplificación de la diana
La amplificación de la diana se produce mediante AMT, que utiliza dos enzimas: una retrotranscriptasa (con actividad de la ADN-polimerasa dirigida por ARN y dirigida por ADN, así como actividad de la ribonucleasa H) y la ARN-polimerasa de bacteriófagos T7. El cebador 1 (que incluye una secuencia T7-promoter) se une a la diana, y la retrotranscriptasa lo extiende para crear la primera cadena de ADN complementario (ADNc). Una vez que se completa la doble cadena de ARN/ADN, la actividad de la ribonucleasa H de la retrotranscriptasa digiere la cadena de ARN de la doble cadena de ARN/ADN, dejando solo el ADNc. A continuación, el cebador 2 (cebador non-T7) se une al ADNc, y la retrotranscriptasa cataliza la síntesis de otra cadena nueva de ADN utilizando el ADNc como plantilla, lo que genera así el intermedio de ADN bicatenario, que incluye la secuencia T7-promoter. La ARN-polimerasa T7 reconoce ahora la secuencia promotora en el intermedio de ADN y transcribe numerosas copias (100–1000) del amplicón de ARN. Los amplicones de ARN creados se unen al cebador 2 y se extienden mediante retrotranscriptasa para crear la primera cadena de ADNc nuevo, con lo cual se genera una doble cadena híbrida de ARN/ADN para repetir el ciclo y dar lugar a una amplificación de aproximadamente 1000 millones de veces en 30 minutos.
Detección mediante AMT
La detección se consigue mediante el análisis de protección de la hibridación (APH), que utiliza sondas de ácidos nucleicos monocatenarios marcadas con éster de acridinio (EA) que son complementarias al amplicón. Estas sondas se hibridan específicamente con el amplicón, mientras que el marcado de EA de las sondas sin hibridar se inactiva mediante hidrólisis durante el paso de selección posterior a la hibridación.
Se utiliza un análisis cinético doble (DKA) para detectar simultáneamente las señales de los ácidos nucleicos víricos y del CI. El análisis utiliza sondas monocatenarias marcadas con dos tipos diferentes de moléculas de EA, que difieren en cuanto a la cinética de la emisión de luz, lo que permite detectar dos analitos en una sola reacción. El amplicón específico para el ácido nucleico vírico se detecta mediante sondas con una cinética de emisión de luz relativamente más lenta (señal brillante), mientras que el amplicón específico del CI se detecta utilizando una sonda de emisión luminosa rápida (señal destellante). La señal quimioluminiscente que producen las sondas hibridadas se mide en un luminómetro y se notifica en forma de unidades lumínicas relativas (ULR).
Ventajas de la AMT para detectar infecciones transmitidas mediante transfusiones
La AMT ofrece varias ventajas con respecto a los análisis convencionales basados en la RCP:
- La RCP requiere instrumental de ciclos térmicos, mientras que la AMT necesita un control de temperatura mucho más moderado para la amplificación isotérmica. Los tres pasos del análisis AMT (captura, amplificación y detección de la diana) se realizan en un único tubo, con menos pasos mecánicos y un tiempo de procesamiento más rápido que la RCP.
- El riesgo de contaminación cruzada (un problema importante en los laboratorios de RCP) en el análisis de AMT es muy reducido, ya que utiliza una reacción en un solo tubo con pocos pasos de procesamiento.
- La ausencia de un paso aparte entre la purificación y la amplificación simplifica el instrumental y el procesamiento.