Algorytmy postępowania w wypadku rozbieżnych wyników testów

Badania przesiewowe krwi mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia bezpieczeństwa dostaw krwi i unikania czynników ryzyka, takich jak zakażenia poprzetoczeniowe. Bezpieczeństwo zależy jednak od dokładności wyników badań przesiewowych krwi. Ponieważ zdarzają się wyniki zarówno fałszywie dodatnie, jak i fałszywie ujemne, do potwierdzenia wyników można stosować jednocześnie testy immunologiczne i nucleic acid technology testing (NAT) (testy oparte na amplifikacji i detekcji kwasów nukleinowych). W przypadku rozbieżności wyników uzyskanych tymi dwiema metodami analitycznymi, konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań w celu uzyskania jednoznacznych wyników. Co się stanie, na przykład, jeżeli infekcja zostanie wykryta za pomocą testu immunologicznego, ale nie testu NAT? W tym tekście zostaną omówione potencjalne scenariusze dotyczące rozbieżnych wyników uzyskanych za pomocą NAT i sposobu ich rozstrzygnięcia.

Testy immunologiczne i NAT w badaniach przesiewowych krwi

Badania przesiewowe wykorzystujące testy immunologiczne

Test immunologiczny to test wykorzystujący swoistość reakcji antygen-przeciwciało do wykrycia i (lub) określenia stężenia cząsteczek docelowych, takich jak przeciwciała wytwarzane w odpowiedzi na infekcję lub antygeny.

Testy oparte na amplifikacji i detekcji kwasów nukleinowych

NAT to wysoce czuła, swoista technika wykrywania materiału genetycznego wirusów przenoszonych drogą krwi, takich jak wirus ludzkiego niedoboru odporności (HIV), wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) i wirus zapalenia wątroby typu B (HBV). Technika ta polega na amplifikacji, a następnie wykrywaniu, wybranych docelowych sekwencji wirusowych kwasów nukleinowych. Oznaczenie Grifols Procleix Ultrio Elite (stosowane łącznie ze zautomatyzowanym systemem Procleix Panther) jest jakościowym testem in vitro typu NAT służącym do badań przesiewowych pod kątem RNA HIV-1 i HIV-2, RNA HCV i DNA HBV w próbkach osocza i surowicy pochodzących od poszczególnych dawców.

Próbki reaktywne w oznaczeniu Procleix Ultrio Elite można dalej poddawać poszczególnym oznaczeniom różnicującym Procleix Ultrio Elite HIV, HCV i (lub) HBV w celu określenia, czy reaktywność wywołana jest obecnością wirusów HIV, HCV, HBV lub dowolną ich kombinacją. Oznaczenie różnicujące obejmuje te same trzy główne etapy, co oznaczenie Procleix Ultrio Elite (przygotowywanie próbki/wiązanie z sekwencją docelową, transcription-mediated amplification, [TMA] [amplifikację przez transkrypcję] i wykrywanie), z jedną różnicą: na etapie wykrywania wykorzystuje sondy swoiste dla wirusów HIV, HCV lub HBV zamiast sondy oznaczenia Procleix Ultrio Elite. Oznaczenie różnicujące Procleix Ultrio Elite HIV nie pozwala stwierdzić, czy próbka jest reaktywna względem HIV-1, czy jest reaktywna względem HIV-2.

Jakie scenariusze są powiązane z rzadkimi wynikami testów?

• Scenariusz 1: Próbka jest reaktywna w teście immunologicznym, nie jest reaktywna w teście NAT: próbka osocza dawcy jest reaktywna (tj. obecne są oznaki zakażenia) w teście immunologicznym w kierunku HIV-1, ale nie jest reaktywna w oznaczeniu Ultrio Elite. Czy to wskazuje na jakiekolwiek problemy z testem typu NAT?
• Scenariusz 2: Próbka jest reaktywna w teście immunologicznym, jest niepowtarzalnie reaktywna w teście NAT (tj. nie jest reaktywna w powtórnym badaniu): próbka osocza dawcy jest reaktywna w oznaczeniu serologicznym w kierunku HIV-1 i reaktywna w oznaczeniu Ultrio Elite. Jednakże jest niereaktywna we wszystkich trzech testach różnicujących Ultrio. Czy oznacza to, że test przesiewowy Ultrio jest fałszywie reaktywny? Czy testy różnicujące są mniej czułe niż test przesiewowy Ultrio? A może test immunologiczny jest fałszywie reaktywny?
• Scenariusz 3: Próbka nie jest reaktywna w teście immunologicznym, jest reaktywna w teście NAT: próbka osocza dawcy nie jest reaktywna w oznaczeniu serologicznym, ale jest reaktywna w oznaczeniu Ultrio Elite. Czy oznacza to fałszywy reaktywny wynik oznaczenia Ultrio?

A może próbki są reaktywne w oznaczeniu discriminatory HCV (dHCV) (oznaczenie różnicujące w kierunku HCV), zaś nie są reaktywne w oznaczeniach discriminatory HIV (dHIV) (oznaczenie różnicujące w kierunku HIV) i discriminatory HBV (dHBV) (oznaczenie różnicujące w kierunku HBV). Próbka pozostaje niereaktywna w powtórzonych i alternatywnych oznaczeniach serologicznych. Czy oznacza to, że testy serologiczne są fałszywie niereaktywne?

Rzadkie wyniki testów są przewidywalne i możliwe do wyjaśnienia

Scenariusz 1: Jak to możliwe, że dawca może być reaktywny serologicznie w kierunku HIV-1, ale nie być reaktywny w NAT?

U około 0,2 - 0.5% osób zakażonych HIV-1 wiremia jest czasami niewykrywalna nawet w teście NAT. Osoby takie są określane mianem „Elite Controllers” („elitarni kontrolerzy”). Ich układ odpornościowy wykazuje odpowiedź humoralną na infekcję, ale miano wirusa jest bardzo niskie. U takich osób może nie występować choroba związane z infekcją wirusem HIV i czują się one wystarczająco dobrze, aby oddawać krew. Mogą nie doświadczać objawów, mogą nie stwierdzać objawów lub mogą podawać nieprawdziwe informacje odnoszące się do ryzykownych zachowań związanych z chorobami przenoszonymi drogą płciową. Możliwe jest również, że osoba zakażona HIV, która jest poddawana terapii antyretrowirusowej, może oddawać krew.²

Scenariusz 2: W jaki sposób dawca może być nie być reaktywny w ponownym teście w kierunku HIV-1, ale pozostawać reaktywny serologicznie?

Wiremia u tej osoby jest prawdopodobnie bardzo niska, bliska granicy wykrywalności w teście NAT; dlatego też materiał genetyczny wirusa jest czasami wykrywalny, a w innych przypadkach niewykrywalny. Może to wynikać z faktu że:

• Dawca jest elitarnym kontrolerem (rzadki przypadek) lub jego układ immunologiczny (na razie) hamuje wiremię
• Dawca może mieć dodatni wynik testu w kierunku HIV-1 i przyjmować leki antyretrowirusowe i nadal oddawać krew (sytuacja zdarzająca się rzadko, ale możliwa)
• Test NAT stochastycznie (losowo) wykrywa RNA HIV-1 ze względu na niską wydajność testu (zdarza się to rzadko, ale wiadomo, że jest możliwe, np. na skutek niedopasowania sekwencji sondy/startera)

W takich przypadkach, jeśli można poprosić dawcę o poddanie się dalszymi badaniom, można wykryć wyższe miano wirusa.

Scenariusz 3: W jaki sposób dawca może być reaktywny w teście NAT, ale nie być reaktywny serologicznie?

Jest to najprawdopodobniej przykład „okienka serologicznego”, rozumianego jako czas od chwili infekcji do momentu, w którym obecność wirusa może zostać po raz pierwszy wykryta we krwi (poprzez wykrycie przeciwciał, antygenów, DNA lub RNA). Dla wszystkich testów można wykazać istnienie „okienka”, którego długość różni się w zależności od testu. Na przykład w przypadku wirusa HCV szacowana długość „okienka” wynosi:

• Trzy dni w przypadku testu NAT przeprowadzanego podczas individual donations (ID-NAT) (poszczególnych donacji)
• Pięć dni w przypadku testu NAT przeprowadzanego dla mini pool NAT (MP-NAT czyli małej puli, tj. próbki dawców są łączone w małe partie przed badaniem)
• Sześćdziesiąt pięć dni w przypadku wykrywania przeciwciał anty-HCV

W związku z tym przy infekcji wirusem HCV próbka może być reaktywna w teście NAT przez okres do 2 miesięcy zanim dawca będzie wykazywał dodatni wynik testu immunologicznego, a w tym trwającym 2 miesiące 2 miesiące okresie próbka dawcy będzie reaktywna w teście NAT, ale nie będzie reaktywna serologicznie (tj. scenariusz 3).

Jaka jest przyczyna rozbieżnych (niezgodnych) wyników testów immunologicznych i NAT?

Jak wspomniano powyżej, sprzeczne wyniki testów immunologicznych i NAT można wyjaśnić istnieniem okienek dla obu testów. W przypadku infekcji wirusem HIV, przeciwciała anty-HIV mogą być niewykrywalne w teście immunologicznym do 15 dni po zakażeniu, natomiast RNA wirusa HIV można wykryć za pomocą testu NAT już po 10 dniach od infekcji, co odzwierciedla znacznie większą czułość tego testu. Ze względu na różnice czułości obu testów, pomiędzy 10 i 15 dniem po infekcji, dawca byłby reaktywny w teście NAT, ale niereaktywny serologicznie. Sprzeczne wyniki można również zaobserwować u elitarnych kontrolerów, u których reaktywność serologiczną stwierdza się od 15 dni po zakażeniu, ale którzy mogą pozostawać niereaktywni w teście NAT ze względu na bardzo niską wiremię.

Jaki jest powód braku powtarzalności wyników reaktywnych w teście NAT?

Testy NAT są bardzo czułe, jednak podobnie jak wszystkie testy analityczne, mają limit of detection (LOD) (granicę wykrywalności). LOD to wartość statystyczna; definiuje się ją jako najniższe stężenie lub ilość materiału, sekwencji docelowej lub analitu konsekwentnie wykrywalne. Wskaźnik wykrywalności wirusa wynoszący 95% to taka wiremia, dla której test daje wynik „reaktywny” przez 95% czasu, a wskaźnik wykrywalności wirusa wynoszący 50% to taka wiremia, dla której test daje wynik „reaktywny” przez 50% czasu.

W przypadku testu NAT przewidywane 95% i 50% wskaźniki wykrywalności w jednostkach międzynarodowych (IU) na ml dla każdej standardowej sekwencji docelowej WHO (wirusowego RNA lub DNA) określa się za pomocą analizy probitowej na danym poziomie czułości statystycznej.

• W przypadku HIV-1, przewidywana wartość 95% wskaźnika wykrywalności wyniosła 18,0 IU/ml dla oznaczenia Procleix Ultrio Elite i 17,3 IU/ml dla oznaczenia różnicującego Procleix Ultrio Elite HIV
• W przypadku HIV-2, przewidywana wartość 95% wskaźnika wykrywalności wyniosła 10,4 IU/ml dla oznaczenia Procleix Ultrio Elite i 9,6 IU/ml dla oznaczenia różnicującego Procleix Ultrio Elite HIV
• W przypadku wirusa HCV, przewidywana wartość 95% wskaźnika wykrywalności wyniosła 3,0 IU/ml dla oznaczenia Procleix Ultrio Elite i 2,4 IU/ml dla oznaczenia różnicującego Procleix Ultrio Elite HCV
• W przypadku wirusa HBV, przewidywana wartość 95% wskaźnika wykrywalności wyniosła 4,3 IU/ml dla oznaczenia Procleix Ultrio Elite i 4,5 IU/ml dla oznaczenia różnicującego Procleix Ultrio Elite HBV

 
Należy zauważyć, że nie ma istotnej statystycznie różnicy pomiędzy wartościami wskaźników wykrywalności dla oznaczenia przesiewowego i różnicującego.

Jeśli wiremia dawcy jest bardzo niska, badana próbka może, ale nie musi, zawierać wirusa. W takim przypadku, czysto losowo, początkowa próbka badana mogła zawierać wystarczającą liczbę cząstek wirusa, która pozwoliła na wykrycie reaktywności, ale liczba cząstek wirusa nie była wystarczająca, aby próbka dała wynik dodatni w teście różnicującym. Takie niepowtarzalnie reaktywne wyniki można rozstrzygnąć:

• Prosząc o dostarczenie drugiej próbki od dawcy („kontrola”). W miarę postępu infekcji wiremia może się zwiększać do poziomu, które można wykryć w sposób powtarzalny
• Można wykorzystać algorytm testowy do określenia, czy w próbce możliwe jest uzyskanie wyniku „prawdziwie” dodatniego lub „prawdziwie” ujemnego.
• Powtórzone badanie próbki może ujawnić niską wiremię.

Algorytmy testowe służące rozstrzygnięciu sprzecznych wyników oznaczenia

Istnieje wiele algorytmów; poniżej przedstawiono trzy przykładowe algorytmy, które zastosowano w różnych regionach świata. Często na wybór algorytmu ma wpływ rozpowszechnienie infekcji w populacji dawców w danym regionie. Ponadto dostępność zasobów pozwalających na powtórne wykonanie testów wpłynie na zakres i złożoność algorytmu rozstrzygania wyników testu.